‌Robert Guillaume rozpoczął swoją karierę od występów na deskach teatru, występując w musicalu Guys and Dolls, który składał się wyłącznie z czarnoskórych aktorów. Jego rola Nathana Detroita przyniosła mu nominację do Tony Award w roku 1977. Osiągnąwszy większą popularność, aktor przeszedł do telewizji, gdzie wystąpił w sitcomach takich jak Soap (1977-1979) czy Benson (1979-1986). Wcielał się wówczas w postać Bensona DuBoisa, z którym był kojarzony aż do dziś. Jego kreacja zaowocowała statuetką Emmy.

Na przełomie lat aktor pojawiał się w licznych produkcjach filmowych i telewizyjnych, należących do przeróżnych gatunków. Występował między innymi w serialach North & South, Pacific Station, Fish Police czy Good Times, a także w filmach Spy Hard, Syn prezydenta, Mastergate, czy Big Fish. Aktor podkładał również głos pawianowi Rafikiemu w animacji The Lion King.

Guillaume zmarł w wieku 89 lat.