Neil Patrick Harris wychował się w Ruidoso w hrabstwie Lincoln w Nowym Meksyku. Edukował się w La Cueva High School w Albuquerque. Jako dziecko występował w przedstawieniach szkolnych oraz na obozach teatralnych.

Karierę filmową rozpoczął bardzo wcześnie. Debiutował w 1988 roku rolą Dawida Harta w filmie pt.: Serce Klarity. Za tę kreację otrzymał nominację do Złotego Globu oraz do Young Artist Award. W serialu ABC Doogie Howser, lekarz medycyny grał rolę 14-letniego lekarza-geniusza. Większą sławę przyniósł mu udział w serialu pt. Jak poznałem waszą matkę, w którym wcielił się w postać Barneya Stinsona.